一、緒言：
生物科技之研發歷史迄今雖僅數十年頭，然由於相關知識與科技之快速進展，而奠定了扎實之生物科技根基。尤其自從人類基因體計畫完成後，生物科技領域更邁入另一新的紀元，而成為二十一世紀最具發展潛力的科技。應運而生之應用發展更於近年來受到重視，各科技大國莫不投入大量人力及經費從事教育、研究與產業之開發。為因應生物科技之突破發展與應用，我國亦將生物科技產業規劃為未來之明星產業，並將之 列為台灣邁向二十一世紀之重點科技；其中，動物基因轉殖技術之開發與應用亦為重點生物科技發展項中之重要項目。基因轉殖動物除可改進家畜生產性能及增強家畜抗病力外，並可作為人類疾病研究、基因調控機制和探討基因功能性之素材。再者將基因轉殖動物作為生產人類所需醫藥產品之生物工廠，藉由其產物如乳汁純化，用以生產高價位之醫藥蛋白；或作為異種器官移植之器官來源等，這些新興科技將可為生技產業開創另一商機。
動物經由遺傳工程技術，透過人為方式，將帶有外源遺傳基因或特定之基因組 DNA 序列進行刪除或更改之動物，均稱基因轉殖動物。目前將外源基因轉殖至動物染色體，以產製基因轉殖動物之方法有數種，包括顯微注射法（microinjection method）、反轉錄病毒感染法(retroviral vector infection method)、胚幹細胞載體法(embryonic stem cell method)、精子載體法(sperm vector method)及體細胞核轉置法（somatic cell nuclear transfer method） 。其中以顯微注射法係目前最被廣泛應用者，而體細胞核轉置法則是未來最具發展潛力者。
二、基因轉殖動物產製方法：
(一)、基因顯微注射法
以原核胚基因顯微注射法，成功產製基因轉殖動物的報告首被發表在 1980年代；然此法迄今仍被廣泛使用在產製基因轉殖動物，且證實能有效且穩定的獲得基因轉殖動物；對產製基因轉殖之家畜而言，此法可能是最顯著方便之途徑以達成家畜基因轉殖之目的；至於使用原核基因顯微注射法的優點有：(1)外源DNA在宿主動物染色體上的整合效率較高，尤其是小鼠整合率可達20∼30 ﹪；(2)由於外源基因之導入會先於雌雄原核融合，故外源基因可以整合到宿主細胞染色體內，且被轉殖之基因，可保有其整套之序列。由此產生的基因轉殖動物所有組織和細胞，包括體細胞和生殖細胞，即帶有這一外源基因，且其整合的位置與基因套數(copy number)基本上都一樣，被嵌入之外源基因可正常地在生殖細胞系中被傳承(transmission)給子代；(3)不需要載體（即無需病毒複製點和質體），並能預測轉殖基因表現的方式；(4)對導入的基因大小要求不嚴格，甚至可導入50∼100 kb DNA的片段。
然而，應用顯微注射法亦有缺點，如： (1)需具備產生眾多單細胞胚之有效技術；(2)顯微操作設備之價格昂貴；(3)嫻熟靈巧之顯微注射經驗需較長時間之磨練；(4)外源基因注入胚原核後，係以逢機方式嵌入基因組DNA，以基因顯微注射法無法掌握其嵌插情形。此外，顯微操作亦殊為耗時；以豬胚為例，豬胚因含有許多不透明之脂肪物質，需經遠心分離處理，並在顯微鏡下將胚旋轉至適當角度，始可顯露其細胞核，供基因之正確注入，致其顯微操作速度緩慢耗時。
進行顯微注射之較佳條件有： (1) DNA之套數，500∼1000 copies/2 pl；(2) 溶解DNA之緩衝液，TE (10 mM Tris HCL, 0.1 mM EDTA, pH 7.5)；(3) DNA之型態，線形且具突起粘端者；(4)DNA注射位置，雄原核、或雌原核內；(5) 所使用的小鼠胚為雜交者。具有純熟之顯微注射與胚移置技術之操作者，若能配合上述條件，進行小鼠之基因顯微注射，其外源基因整合成功之機率可達24∼31%。
(二)、反轉錄病毒感染法
應用此法之緣由乃因，反轉錄病毒 (retrovirus)具有感染宿主細胞並將其DNA嵌入細胞染色體DNA中之能力。當反轉錄病毒侵入細胞後，反轉錄病毒的單股RNA鏈即反轉錄為雙股之DNA，進而嵌入基因組DNA中，成為前驅病毒(provirus)，前驅病毒可以整合到宿主染色體中任意位置。 本基因轉殖法之主要步驟，係將選殖之基因，先行嵌入一適當之反轉錄病毒載體 (如在小鼠中常使用之M-MuLV載體)。然後再將此等帶有該選殖基因之反轉錄病毒載體，與4∼8細胞階段且透明帶已被移除之胚，在體外共同培養16∼24 小時，俾將外源基因帶入胚之基因組中。 本法雖較少應用於哺乳動物，亦仍有轉殖成功的報告。此法之最大優點乃一次可同時處理數目眾多之胚，且祇要實驗室具備反轉錄病毒之經驗者，即可輕易完成試驗，而無需仰賴嫻熟之顯微操作技術。惟其最大缺點則常產生鑲嵌體(mosaic)之後代，且所產生之基因轉殖仔小鼠，可在生殖細胞系中被傳承者較以顯微注射法產製者為低。此外，鑒於基因必需被病毒包裝成具有產生感染力之病毒顆粒，因此欲將轉殖基因經由此等病毒帶入胚中，其大小必須被限制在10 kb以下。 新近，Chan et al .(1998)進一步以體外成熟培養16-17小時之牛卵母細胞，以顯微注射方式將反轉錄病毒顆粒注入卵黃膜間隙，俾進行感染後，再繼續其成熟及受精培養，於體外受精後之早期胚培養結果發現，受精卵中有21%可發育至囊胚期階段，其中10個囊胚分別被移置於5頭受胚牛之子宮中，結果3頭母牛懷孕並順利生下4頭小牛，經分析結果證實4頭小牛均為基因轉殖者，轉殖效率達出生動物之100%，目前亦已證實可將外源基因傳承至後代，此結果提示，以反轉錄病毒感染方式進行基因轉殖，若將被感染之胚期推進至卵成熟前階段，其基因轉殖效率可達出生動物之100%， 此為反轉錄病毒法應用於產製大型基因轉殖家畜開啟新的紀元。
(三)、胚幹細胞載體法
胚幹細胞 (embryonic stem cells, ESC)係源自內細胞群(inner cell mass, ICM)之細胞，經體外株化後所建立之細胞系。其特性乃具全能性(totipotency)分化能力或多分化潛能(pluripotent)，當被株化之ESC或內細胞群細胞團被注入早期囊胚腔後，可與宿主之內細胞群發生嵌合，並參與宿主細胞之分化，並將發育成胚體之各部組織。設若此等注入之胚幹細胞，能成功地參與性腺分化，則可成為生殖細胞系之成員，遂使此等源自胚幹細胞之遺傳物質得以傳承至其後裔之全部組織。
迄今已有多種外源基因轉殖於胚幹細胞之方法可供選擇，包括： (1)化學藥劑誘導法－係將外源基因片段以磷酸鈣聚乙二醇誘導或DEAE糊精沉澱之方法引入細胞中；(2)生物媒介法－將攜有轉殖基因之脂質體(liposome)及反轉錄病毒分別以融合及轉染(transfection)之方法，將外源基因引入細胞中；(3)物理或機械處理法－以顯微注射法與電穿孔法(electroporation)將外源基因嵌入體外培養之胚幹細胞內。經選殖帶有該外源基因之胚幹細胞株後，再藉顯微注射法將之注入囊胚腔中，並使其與囊胚之內細胞群細胞相融合，俾產生嵌合胚(chimeric embryos)。經由此等嵌合胚所產生之嵌合體動物，顯然必須經過迴交配種後，方可獲得真正之基因轉殖動物。
應用胚幹細胞融合法進行基因轉殖之基本前提，首需建立有效之胚幹細胞系，且此等幹細胞在生殖細胞系中亦須具有高傳承率。迄今，在小鼠已有許多良好之胚幹細胞系被成功建立，且已用之多年。然而，源自家畜胚之幹細胞，則迄今未被有效建立。雖然新近曾有人將豬胚、牛胚、與綿羊胚之內細胞群細胞自體外予以培養，並根據其細胞形態及分化能力加以研判，指稱其已分別在豬、牛與綿羊等動物之胚，初步分離出某些疑似胚幹細胞之細胞系，惟此等細胞能否真正被用以產生基因轉殖家畜，則有待進一步之試驗。此外，在應用胚幹細胞進行基因定位 (gene targetting)或剔除(knock out)時，可將外源基因以同源組合(homologous recombination)之方式植入胚幹細胞之基因組內，再依前述方法注入囊胚腔中；或配合先行育成具組織專一性之Cre-loxP的基因轉殖動物，再將其與該指定位置基因轉殖動物配種，則可用以生產組織專一性基因轉殖及剔除之動物。
(四)、精子載體法
本方法係首由義大利科學家 Lavitrano et al .(1989) 開創成功。氏等在體外先將小鼠精子與外源基因共同培養，令該外源基因與精子相結合後，再以此等帶有外源基因之精子，進行體外受精，將外源基因成功帶入受精卵之基因組中。氏等甚至宣稱，應用相同技術亦已成功獲得基因轉殖豬之出生，且成功率高達30%；不過令人遺憾的是不少試驗室無法重覆Lavitrano等人的試驗。1997年，Lavitrano et al .再次以精子載體法證實精子可藉由受精作用，將外源之人DAF(decay-accelerating factor)基因傳遞至卵母細胞，且獲得12頭可表現DAF蛋白質之基因轉殖豬。再者，Perry et al .(1999)利用小鼠卵母細胞之細胞質內單一精子注射(intracytoplasmic sperm injection, ICSI)技術，證實了外源基因可藉由精子頭部作為載體，達基因轉殖之目的；最近，在魚、小鼠、豬和牛亦陸續用精子載體法成功產下基因轉殖子代。應用此方法生產基因轉殖動物，不僅可以免去使用複雜而昂貴的顯微操作設備，且可省略不少繁雜的操作和準備工作。因此，鑒於精子載體法，一旦可穩定重複成功後，其簡便性將遠勝於其他方法者。
(五)、 體細胞核轉置法
新近為加速畜群之遺傳改進及提高家畜生產效益，胚之無性增殖 (embryo cloning)及基因轉殖技術逐漸受重視。早期複製同源家畜個體之研究偏重於以胚葉細胞(blastomere)當供核者之核轉置技術上，然由之以獲得眾多數目之同源個體仍有其限制。若能使用全能性(totipotency)之細胞株(指胚幹細胞)作為供核者，並移置於受核者之細胞質(尤其源自體外成熟卵母細胞者)後，可獲得大量具有發育成健康個體能力之早期胚，則家畜核轉置技術之應用將更為廣泛。惟迄今 源自家畜胚之幹細胞仍未被有效建立，因此擬藉由家畜胚幹細胞作為外源基因之載體，以生產基因轉殖家畜之目標，將倍增困難。為解決此等困境，體細胞核轉置技術之成功開發將是目前唯一可行之路徑。
可喜的， Wilmut et al .(1997)終於利用已分化之成年綿羊的乳腺上皮細胞為供核源，成功產製世界第一頭體細胞核轉置綿羊-桃麗(Dolly)，此結果說明，分化後之細胞核亦可透過人為之處理方式，迫使其被重新被調控至分化前之狀態，同時此創舉也突破了家畜核轉置及基因剔除技術之研究瓶頸。體細胞核轉置技術一般除被應用於複製吾人所需之特殊種源動物外，在畜產上也可用以複製相同遺傳背景之高產性能家畜。若進一步配合分子生物學及遺傳工程技術，則可用以生產基因轉殖動物，並有取代基因顯微注射技術及胚幹細胞法生產基因轉殖動物之優勢。
利用體細胞核轉置技術產製基因轉殖動物之 成功例證，首由 Schnieke et al .（1997）所建立。作者先於體外進行綿羊的胎兒成纖維母細胞之初代培養，再將綿羊β乳球蛋白啟動子(ovine β-lactoglobulin promoter)與人類第九凝血因子(human factor IX)和抗新黴素基因( neomycin resistance gene, Neo r ) 構築而成的融合基因轉染入胎兒成纖維母細胞中，並於體外培養期間以新黴素篩選，於體外即挑選出帶有外源基因的細胞作為供核細胞，配合血清飢餓法調控，進行核轉置動物的產製，結果在五頭出生存活的仔綿羊中，經過基因組DNA分析，證實五隻皆帶有外源基因，基因轉殖的效率達到100 ﹪；相較於一九八九年以後，以原核顯微注射法產製基因轉殖羊的效率（4.35 ﹪）高出了許多，而證實體細胞核轉置法確有明顯提高基因轉殖效率之能力。
以供核體細胞株為載體進行家畜之基因轉殖，可先行於體外進行基因轉殖後之細胞篩選，並能有效將產製效率提升為出生動物之 100%；目前，已證實體細胞於長時間體外培養後，亦可產製核轉置動物，因此未來將可利用此法進行基因定位及剔除之工作，以助於將基因做最適當的調控；惟在核轉置後，胚之發育潛能仍低，其改善之策略尚有待研究者進一步探討及解決，冀往後複製動物之過程可達例行化之境界。
三、動物基因轉殖技術之應用：
基因轉殖動物除了可提供科學家對特定基因的功能做基礎研究外，亦有許多實際之應用層面；在農業之應用方面，可用以改善畜產動物之生長表現，改善產品的成分，增加特定營養成分、生產抗疾病之畜產動物和作成生物反應器以生產生物藥劑等；在醫學之應用方面，可供解讀基因的功能並獲得新的知識、研究基因對生理系統的調控、建立人類疾病的動物模型， 探討人類疾病的致病機轉 、製造醫療用的動物產品以及作為異種器官移植（ xenotransplantation）之器官捐贈者。
雖然基因轉殖動物之應用層面很廣，且相關之 分子生物學、基因工程及基因轉殖技術之研發，均已達純熟之階段，惟目前已被選殖及構築之基因，其調控機制與功能性之瞭解仍佔人類整體基因中之少數。其中具有經濟價值，並可於家畜獲得適當表現，能提高家畜生產性能及抗病力者為數尚少。所幸，近年來動物、植物、甚至人類等之基因組 DNA定序工作，均在全球各地陸續展開，並持續解密中。相信待人類及其它生物基因之奧秘被逐漸解開後，將有更多具經濟價值之標的基因可被應用。
過去的歷史告訴我們，科技的進步雖帶給人類便利且優質的生活，但相對的也帶來負面的影響，因此，當人類在享受動物基因轉殖科技所可能改善人類生活品質之同時，亦應考慮到此項技術所衍生之問題，例如基因轉殖動物之安全管理及其對自然環境的影響、基因轉殖畜產品的安全性及社會大眾的接受程度等，唯有防範未然才擁有永續經營之可能。
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